Clorochina 176

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Dorman: Analisi gel clorochina Da OpenWetWare Questo è un metodo utilizzato per monitorare il superhelicity di un plasmide reporter di esempio pUC18 o pBR322. plasmidi grandi possono essere usati ma la risoluzione topoisomero nel gel è migliore con plasmidi più piccoli. Inoltre, pUC18 è molto alto numero di copie che lo rende facile da estrarre da bassi volumi di coltura. Un mini-prep standard da 1 o 2 ml di cultura durante la notte di solito fornisce l'abbondanza di plasmide per l'analisi del gel clorochina. Procedura: Gel e tampone sono fatti di 2X TBE. Make up 2 litri di tampone 2X TBE (compriamo nostra come uno stock 10X) e circa 1 ml di clorochina (25 mg / ml, preparati in acqua). Si tratta di uno stock 10.000X. Aggiungere 3 g di agarosio a 300 ml tampone per fare un 1 gel. Sciogliere la soluzione di agarosio e lasciare raffreddare leggermente prima di aggiungere 30 l clorochina (dà una concentrazione finale di 2,5 g / ml). Tape le estremità del grande serbatoio di gel e versare la clorochina. Mettere nel pettine, coprire il gel e lasciarlo tosolidify. Quando solido, aggiungere 170 l clorochina ai 1,7 litri di tampone. Versare questo nel serbatoio gel in modo da coprire il gel. Rimuovere i campioni pettine e di carico (i pozzi prendono 20 L). Se si utilizza il colorante 6X fornito da Promega con scale di DNA, è necessario utilizzare come colorante 1X (2X TBE ha un assetto diverso per condizioni di elettroforesi normali). In alternativa, costituiscono un colorante riscaldando 100 glicerolo (calore per consentire un facile pipettaggio) e il colorante (per permettere la visualizzazione del campione nella corsia). Conservare il colorante in un blocco di riscaldamento a 70 gradi C accanto al serbatoio di gel durante il caricamento. Il modo più semplice per caricare è il primo a individuare 20 L di ciascun campione sulla parafilm. Con una seconda pipetta p20, aggiungere 3 L dye loading riscaldata al primo campione, scambio alla pipetta fissato a 20 L, miscelare il campione e caricare nella prima corsia. Continuare a farlo con il resto dei campioni. Attivare il gel a 100V (3V / cm) durante la notte (16 ore). Rimuovere il gel dal serbatoio e lavare ripetutamente in acqua di rubinetto per almeno 2 ore. Ciò è essenziale per rimuovere il choroquine dal gel prima colorazione con etidio bromuro (500 mL, 1 g / mL). Mantenere la macchia coperto di carta stagnola durante la conservazione e l'uso come è sensibile alla luce, come l'esposizione ripetuta alla luce riduce la conservabilità. Macchia il gel per almeno mezz'ora, versare il bromuro di etidio nella bottiglia accuratamente e lavare il gel una volta (per pochi secondi) per rimuovere l'eccesso macchia prima visualizzazione ai raggi UV. A concentrazioni clorochina di 2,5 g / mL, molecole supercoiled più negativamente migrano ulteriormente attraverso il gel e le molecole più rilassato migrano più lento. Ad una concentrazione più elevata (25 g / mL) sarà invertita, con molecole più rilassata migrano ulteriormente. NB: I campioni su gel differenti clorochina può essere paragonata solo se viene utilizzato un campione di riferimento comune a tutti i gel. Questo è fatto facilmente e sicuramente vale la pena. (Non importa quali sono le condizioni di riferimento sono il più a lungo theyre coerente.)